體積排阻色譜法（SEC）又稱凝膠色譜法，通常用于分子量大于2000的樣品的分離。SEC方法最廣泛的用途是測定聚合物的分子量分布，對(duì)某些大分子樣品如蛋白質(zhì)、核酸等，也是種很有效的分離純化手段。SEC方法能簡便快速地分離樣品中分子量相差較大的組分，因而適合于未知樣品的初步探索性分離，無需進(jìn)行復(fù)雜實(shí)驗(yàn)就能較為全面地了解樣品組成分布的概況。

體積排阻色譜原理

分子的體積排阻，樣品組分和固定相之間原則上不存在相互作用，色譜柱的固定相是具有不同孔徑的多孔凝膠，在固定相確定的分子量范圍內(nèi)，洗脫順序按照分子大小分布。當(dāng)樣品分子量較大，以至于被完全排除在固定相微孔之外時(shí)（全排阻），其保留體積等于色譜柱內(nèi)微粒間的空隙體積；而分子量足夠小的分子可以完全進(jìn)入微孔中，其保留體積為空隙體積和固定相中微孔體積之和，因此小的溶質(zhì)分子保留時(shí)間長，洗脫體積大，而大的溶質(zhì)分子保留時(shí)間短，洗脫體積小。固定相的分子量測定范圍即為全滲透和全排阻之間的分子量范圍。

理想的體積排阻色譜固定相應(yīng)具有窄的孔徑分布范圍，而系列色譜固定相應(yīng)具有寬范圍的孔徑分布，可根據(jù)樣品的不同選擇不同分子量范圍的SEC柱，也可將不同規(guī)格的SEC柱串聯(lián)使用，用于分離更大分子量范圍的樣品。

體積排阻色譜的分類

凝膠過濾色譜法-GFC

一般用于分離水溶性的大分子，凝膠的代表是葡聚糖系列，洗脫溶劑主要是水。

凝膠滲透色譜法-GPC

主要用于有機(jī)溶劑中可溶的高聚物相對(duì)分子質(zhì)量分布分析及分離，常用的凝膠為交聯(lián)聚苯乙烯凝膠，洗脫溶劑為四氫呋喃等有機(jī)溶劑。

兩種方法的分離原理雖然相同但采用的固定相、分離對(duì)象和使用技術(shù)完全不同。

體積排阻色譜流動(dòng)相的選擇

體積排阻色譜法中，實(shí)際的分離效果與樣品、流動(dòng)相之間的相互作用無關(guān)，因此改變流動(dòng)相的組成一般不會(huì)改變分離度。當(dāng)采用示差折光檢測器時(shí)，為提高檢測靈敏度，應(yīng)使流動(dòng)相的折射率與被測樣品的折射率有盡可能大的差別。若使用紫外吸收檢測器，也應(yīng)采用在檢測波長無紫外吸收的溶劑。

體積排阻色譜法中流動(dòng)相的選擇原則：

01 流動(dòng)相對(duì)樣品應(yīng)有足夠的溶解能力，黏度小，與檢測器匹配。

02 流動(dòng)相必須與固定相匹配，能浸潤凝膠，如對(duì)苯乙烯二乙烯基本聚合物固定相選擇非極性流動(dòng)相；多孔硅膠固定相應(yīng)選擇極性強(qiáng)的流動(dòng)相。

03 為增加樣品溶解度而采用高柱溫操作時(shí)，應(yīng)選用高沸點(diǎn)溶劑。

凝膠滲透色譜主要用于高聚物分子量的測定。四氫呋喃對(duì)此類樣品有良好的溶解性能，可使小孔徑聚苯乙烯凝膠溶脹，因此被廣泛使用作為GPC流動(dòng)相。但因其在儲(chǔ)運(yùn)過程中特別是在光照射條件下，容易生成過氧化物，使用前必須除去。二甲基甲酰胺、鄰二氯苯、間甲酚等溶劑可在高柱溫條件下使用；強(qiáng)極性的六氟異丙醇、三氟乙醇等可用于粒度小于10μm的凝膠柱。

在凝膠過濾色譜中，通常以具有不同pH值的緩沖溶液作為流動(dòng)相。當(dāng)采用親水性有機(jī)凝膠（葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺等）、硅膠或改性硅膠為固定相時(shí)，固定相與樣品間可能存在多種相互作用影響GFC測定準(zhǔn)確性，可在流動(dòng)相中添加少量無機(jī)鹽以保持一定的離子強(qiáng)度（0.1~0.5mol/L），其中鈉、鉀、銨等的硫酸鹽、磷酸鹽消除吸附作用的效果較好。當(dāng)使用硅膠基質(zhì)凝膠時(shí)，流動(dòng)相的pH值應(yīng)保持在4~8的范圍，以免硅膠鍵合相被破壞。

月旭產(chǎn)品介紹

月旭科技Xtimate? SEC填充劑采用獨(dú)特的化學(xué)鍵合技術(shù)，在硅膠表面鍵合親水性聚合物以及親水性二醇基團(tuán)，雙重鍵合機(jī)制使水溶性高分子聚合物蛋白、生物酶、多肽等生物樣品的非特異性吸附極小，因而可廣泛應(yīng)用于水溶性聚合物及生物大分子的分離和測定。

色譜柱的異常沖洗

多次使用后某些樣品可能會(huì)吸附到入口篩板或填料上。當(dāng)積累至一定程度時(shí)會(huì)出現(xiàn)壓力升高并伴隨峰形展寬的異?，F(xiàn)象，需要進(jìn)行特殊的沖洗。

該沖洗的清洗溶液選擇的基本原則：

01 低pH的鹽溶液有助于移除堿性蛋白（如0.5M硫酸鈉溶液，硫酸調(diào)整pH3.0）。

02 有機(jī)溶劑有助于移除疏水蛋白，可以采用含有機(jī)溶劑（如10-20%的甲醇、乙腈、乙醇等）的緩沖溶液（如50mM磷酸鹽緩沖液，pH7.0）。

03 助溶劑有助于去除在固定相上強(qiáng)吸附的物質(zhì)（如通過氫鍵作用等）。

注意：只有在中性鹽溶液或有機(jī)溶劑沒有明顯改善效果的情況下使用助溶劑（如：6-8M的尿素或0.2-0.3%十二烷基硫酸鈉）。

流速一般采用1/2做樣流速，柱長≤100mm，各項(xiàng)沖洗60min；柱長＞100mm，各項(xiàng)沖洗120min。